作者：朱海燕季春燕张海荣
作者单位：中国医院妇产科产前诊断中心
引用格式：朱海燕,季春燕,张海荣.苯丙酮尿症一家系的基因诊断及产前诊断研究[J].中华检验医学杂志,,41(4):-.DOI:10./cma.j.issn.-..04.
摘要
目的研究游离DNA单分子标签检测（cell-freeDNAbarcode-enabledsingle-moleculetest,cfBEST）技术用于苯丙酮尿症（phenylketonuria,PKU）无创产前诊断的适用性和可行性。
方法研究对象为年7月至9月医院进行产前诊断的4例诊断为PAH基因热点突变的苯丙酮尿症家系。采用cfBEST技术进行检测，设计巢式聚合酶链反应引物，计算孕妇血浆游离DNA突变频率和胎儿基因型，并将cfBEST技术的检测结果与介入性产前诊断结果比较。对数据采用描述性统计分析。
结果cfBEST技术检测发现，家系1中c.TG和c.+2TA位点的突变频率为48.40%（/）和9.70%（61/），胎儿2个位点均为杂合突变型，为PKU患者。家系2中c.GC和c.+2TA的突变频率分别为43.70%（/）和0%（0/），胎儿2个位点均为野生型，非PKU患者，亦非携带者。家系3中，c.TG和c.GA的突变频率分别为44.00%（/）和0%（0/），胎儿2个位点均为野生型，非PKU患者，亦非携带者。家系4中，c.GA和c.GA的突变频率分别为45.40%（/）和4.50%（28/），胎儿位点分别为野生型和杂合突变型，为携带者。介入性产前诊断结果与cfBEST技术检测结果完全一致。家系1选择引产，其余3个家系选择继续妊娠至足月分娩，其新生儿筛查苯丙氨酸水平均μmol/L，生后1、3、6月龄电话随访，均未见明显异常。
结论cfBEST技术有望应用于PKUPAH基因的无创产前诊断，但需要更大样本量的研究证实。
苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU；OMIM:)，是人类最常见、研究最深入的常染色体隐性遗传代谢病之一，我国发病率为1/[1]，北方高于南方。多数患者是由于苯丙氨酸羟化酶基因(phenylalaninehydroxylase，PAH)突变[2]，导致肝细胞内PAH缺乏或功能下降，血内过高的苯丙氨酸，经旁路代谢途径产生的过多苯丙酮酸，损害脑及神经细胞。未经合理治疗的PKU患者可以表现为智力低下、癫痫、行为异常等，患儿可有特殊体味(鼠尿味)、色素减低、湿疹等。PKU是少数可以治疗的遗传代谢病，很多国家开展了新生儿PKU筛查，以及时发现患者，尽早治疗。对于生育过PKU患儿的家庭，分子遗传学诊断是早期诊断的有效手段，多采取DNA序列分析的方法对胎儿进行基因型检测，从而评估胎儿的发病风险。同时，位于PAH基因3号内含子的(TCTA)n四核苷酸短串联重复(shorttandemrepeats，STR)，具有高度多态性[3]，可用于PKU家系单体型分析协助产前诊断。
本研究为有PKU遗传病家族史的孕妇提供遗传咨询，为家族中的先证者(新生儿筛查发现PKU患儿)进行基因检测，明确了致病突变，并在同一家系的不同家庭组成成员中，发现了不同基因突变的携带者，并为家系提供科学的遗传咨询，并进行了有效的产前诊断。
一、对象与方法
一、对象
孕妇(Ⅰ：3，图1)，27岁，G1P0，妊娠6周。因其姐姐(Ⅰ：2)2.5年前生育过PKU患儿(Ⅱ：1)，于年10医院就诊，咨询自己是否为致病基因携带者，咨询胎儿(Ⅱ：2)PKU发病风险，是否需要为胎儿进行产前诊断。患儿(Ⅱ：1)，男，2.5岁，足月顺产第一胎，出生时无缺氧窒息，新生儿筛查发现苯丙氨酸(Phe)显著升高(μmol/L)，结合尿喋呤及血二氢喋啶还原酶分析排除四氢生物喋呤缺乏症，在外院临床诊断为经典型PKU。一直采用低Phe奶粉及饮食指导，生长发育良好。就诊时体格检查身高98cm，体重15kg，头围48cm，智力、语言及运动发育均未见异常。患儿父母(Ⅰ：1、Ⅰ：2)因无再生育计划，一直未对患儿进行基因诊断。本研究经中国医院伦理委员会批准，批准号为医伦第号，家系基因诊断及产前诊断均签署知情同意书。
▲图1PKU患儿家系图及家系不同成员PAH基因型
二、方法
1．基因组DNA制备：签署知情同意后，采集患儿(Ⅱ：1)、患儿父母(Ⅰ：1、I：2)、患儿母亲的妹妹(姨妈，Ⅰ：3)及其丈夫(姨夫，Ⅰ：4)的外周静脉血，采用血液基因组DNA抽提试剂盒(QIAampDNAbloodminikit,Hilde，Germany)提取基因组DNA。患儿母亲拒绝为患儿的外祖父及外祖母进行基因检测，故未采集该二人的外周血标本。
2．PAH基因外显子PCR扩增和序列分析：采用primer3软件对PAH基因13个外显子及侧翼序列设计引物，常规PCR扩增。PCR产物纯化回收后，在ABI测序仪上双向测序；测序结果采用DNASTAR软件进行序列分析。根据人类基因组变异协会(HumanGenomeVariationSociety，HGVS，